Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật sắc ký phân tích quan trọng, dựa trên sự phân tách các chất dựa vào ái lực khác nhau của chúng giữa hai pha: một pha động lỏng chảy qua một pha tĩnh được nhồi trong cột. HPLC được ứng dụng rộng rãi, dựa trên các cơ chế như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, loại trừ kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể.
Mục Lục
Thiết Bị HPLC
Hệ thống HPLC bao gồm:
- Hệ thống bơm: Đảm bảo dòng pha động ổn định.
- Bộ phận tiêm mẫu: Đưa mẫu vào hệ thống.
- Cột sắc ký: Nơi diễn ra quá trình phân tách.
- Detector: Phát hiện các chất sau khi tách.
- Hệ thống thu thập dữ liệu: Ghi lại tín hiệu từ detector.
Pha động được chứa trong các bình chứa và được bơm qua cột với tốc độ dòng ổn định, sau đó đến detector.
Hệ Thống Bơm HPLC
Hệ thống bơm phải duy trì dòng pha động ổn định. Biến động áp suất được giảm thiểu bằng các thiết bị giảm xung. Ống dẫn và phụ kiện phải chịu được áp suất cao. Bơm có thể có thiết bị khử khí. Hệ thống điều khiển vi xử lý cho phép rửa giải đẳng dòng hoặc gradient (thay đổi thành phần pha động). Trong rửa giải gradient, bơm hút dung môi từ nhiều bình chứa và trộn chúng ở áp suất thấp hoặc cao.
Bộ Phận Tiêm Mẫu HPLC
Mẫu được đưa vào dòng pha động gần đầu cột bằng bộ phận tiêm mẫu chịu áp suất cao. Có thể dùng vòng chứa mẫu cố định hoặc thay đổi thể tích, vận hành bằng tay hoặc tự động. Tiêm mẫu thủ công có thể gây sai số nếu thể tích tiêm không đủ.
Pha Tĩnh HPLC
Có nhiều loại pha tĩnh, bao gồm:
- Silica, nhôm oxit, than chì xốp: Dùng trong sắc ký pha thuận, phân tách dựa trên khả năng hấp phụ hoặc phân bố.
- Nhựa hoặc polymer chứa nhóm chức acid/base: Dùng trong sắc ký trao đổi ion, phân tách dựa trên cạnh tranh ion.
- Silica xốp hoặc polymer: Dùng trong sắc ký rây phân tử, phân tách dựa trên kích thước phân tử.
- Chất mang biến đổi hóa học (polymer, silica gel, than chì xốp): Dùng trong sắc ký pha đảo, phân tách dựa trên sự phân bố các chất giữa pha động và pha tĩnh.
- Pha tĩnh đặc biệt (dẫn xuất cellulose/amylose, protein/peptid, cyclodextrin): Dùng để tách đồng phân đối quang (sắc ký đối quang).
Phần lớn các phân tích sử dụng silica biến đổi hóa học làm pha tĩnh và dung môi phân cực làm pha động. Bề mặt silica được xử lý bằng các silan để tạo liên kết cộng hóa trị, che phủ các vị trí hoạt động. Bản chất của pha liên kết quan trọng trong việc xác định tính chất tách. Các pha liên kết phổ biến bao gồm:
- C18 (octadecylsilane)
- C8 (octylsilane)
- Phenyl
- Amino
- Cyano
Cột pha đảo silica thường ổn định ở pH 2.0-8.0. Cột than chì xốp hoặc polymer ổn định ở khoảng pH rộng hơn. Sắc ký pha thuận sử dụng silica không biến đổi, than chì xốp hoặc silica biến đổi phân cực (cyanopropyl hoặc diol) với pha động không phân cực. Kích thước hạt pha tĩnh phổ biến là 3-10 μm. Hạt có thể hình cầu hoặc không định hình, với độ xốp và diện tích bề mặt khác nhau. Các yếu tố này ảnh hưởng đến hiệu suất sắc ký. Trong pha đảo, các yếu tố như bản chất pha tĩnh, mức độ liên kết (chiều dài mạch carbon), hoặc khả năng che phủ các nhóm hoạt động bề mặt ảnh hưởng đến quá trình tách. Sự kéo đuôi pic có thể xảy ra do các nhóm silanol bề mặt của silica, đặc biệt với các chất base. Cột thường làm bằng thép không gỉ, với chiều dài và đường kính trong khác nhau. Cột có đường kính trong nhỏ hơn 2 mm được coi là vi cột. Nhiệt độ pha động và cột cần ổn định trong quá trình phân tích. Phần lớn các phân tích thực hiện ở nhiệt độ phòng, nhưng có thể gia nhiệt cột để tăng hiệu quả. Nhiệt độ cột không nên vượt quá 60 °C để tránh phân hủy pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha động.
Pha Động HPLC
Sắc ký pha thuận thường dùng dung môi ít phân cực. Hàm lượng nước trong pha động cần được kiểm soát chặt chẽ. Sắc ký pha đảo dùng pha động chứa nước, có hoặc không có dung môi hữu cơ. Pha động thường được lọc để loại bỏ các hạt lớn hơn 0.45 μm. Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị bằng cách trộn các thể tích hoặc khối lượng chính xác của từng thành phần. Dung môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điều khiển bằng van chia tỷ lệ. Dung môi thường được khử khí trước khi bơm bằng cách sục khí heli, lắc siêu âm hoặc sử dụng hệ thống lọc màng/chân không trực tuyến. Dung môi chuẩn bị pha động thường không chứa chất ổn định và phải trong suốt ở vùng bước sóng phát hiện nếu dùng detector UV. Dung môi và các thành phần khác phải có chất lượng phù hợp. Khi điều chỉnh pH, chỉ thực hiện với thành phần nước của pha động. Nếu dùng dung dịch đệm, cần rửa hệ thống bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ (5 % tt/tt) để ngăn chặn sự kết tinh muối sau khi sắc ký. Pha động có thể chứa các thành phần khác như ion trái dấu trong sắc ký tạo cặp ion hoặc chất chọn lọc đối quang.
Detector HPLC
Detector hấp thụ UV/Vis (bao gồm detector diode array) là phổ biến nhất. Các loại detector khác bao gồm detector huỳnh quang, detector khúc xạ vi sai, detector điện hóa, detector khối phổ, detector tán xạ ánh sáng bay hơi và detector phóng xạ.
Các Đại Lượng Đặc Trưng HPLC
Các đại lượng đặc trưng cho quá trình sắc ký được mô tả trong Phụ lục 5 “Các kỹ thuật tách sắc ký” của Dược điển Việt Nam.
Phương Pháp Tiến Hành HPLC
Cân bằng cột với pha động và tốc độ dòng quy định ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ quy định trong chuyên luận riêng, cho đến khi đường nền ổn định. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Các dung dịch phải không có hạt rắn.
Hiệu Năng HPLC
Quy định về tính phù hợp của hệ thống được mô tả trong Phụ lục 5. Các thông số của hệ thống sắc ký có thể được điều chỉnh để đáp ứng các yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống. Thành phần và tốc độ dòng của pha động được quy định trong chuyên luận riêng. Pha động là hỗn hợp dung môi được đuổi khí bằng bơm chân không hoặc thiết bị đuổi khí khác. Trong quá trình định lượng, nên sử dụng bộ phận tiêm mẫu có thể tích cố định. Trong một số trường hợp ngoại lệ, khi chuyên luận chỉ dẫn tính theo chiều cao pic thì không cần quan tâm đến hệ số đối xứng. Cột sắc ký thường làm bằng thép không gỉ có kích thước (chiều dài X đường kính trong) được quy định trong chuyên luận riêng. Trong chuyên luận riêng, khi pha tĩnh được ký hiệu bằng một chữ cái thì tra cứu ở phần Nguyên vật liệu. Đường kính danh nghĩa của hạt pha tĩnh được để trong ngoặc đơn ngay sau ký hiệu chữ cái cụ thể. Nếu không có chỉ dẫn khác, quá trình sắc ký được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ không đổi trong môi trường phòng thí nghiệm. Khi sử dụng pha động có pH cao với cột silica, nên sử dụng một tiền cột ở trước cột phân tích. Trừ khi có chỉ dẫn khác, hệ thống detector gồm một detector đo quang gắn với cốc đo có thể tích nhỏ (khoảng 10 μl). Phải đặt bước sóng theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng. Khi dùng máy sắc ký có thiết kế riêng biệt có thể phải thay đổi các điều kiện sắc ký. Trong trường hợp này, cần đảm bảo rằng những thay đổi đó cho kết quả tương đương.
Thể Tích Tiêm HPLC
Khi thể tích tiêm không quy định trong chuyên luận riêng, nên chọn một thể tích tiêm phù hợp. Thể tích tiêm phụ thuộc vào đáp ứng của phép phân tích, detector, hiệu lực cột và hiệu năng của hệ thống. Khi không có chỉ dẫn, thường dùng thể tích tiêm là 20 μl, tuy nhiên cần kiểm tra sự thích hợp trong điều kiện cụ thể.
Pic Phụ HPLC
Có thể cần chất đối chiếu để xác định pic phụ. Pic phụ là pic có trên sắc ký đồ nhưng không phải là pic chính, pic chuẩn nội, pic dung môi hoặc pic thuốc thử tạo dẫn xuất.
Nguyên Vật Liệu HPLC
Các dung môi và thuốc thử dùng để pha dung dịch phải có chất lượng phù hợp cho sắc ký lỏng. Khi chuyên luận riêng quy định pha tĩnh được gắn với một chữ cái (A, B, C…), điều đó có nghĩa là các pha tĩnh này được mô tả chi tiết trong phần “Nguyên vật liệu” của Dược điển Việt Nam.