Điện di là một kỹ thuật điện động học quan trọng, được sử dụng rộng rãi để tách các hạt mang điện trong chất lỏng dưới tác động của điện trường. Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong việc phân tích các phân tử sinh học như protein, DNA, RNA và polysaccharide, với nhiều biến thể khác nhau tùy thuộc vào loại và kích thước phân tử cần phân tích.
Mục Lục
NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG CỦA ĐIỆN DI
Điện di hoạt động dựa trên nguyên tắc các phân tử sinh học mang điện tích. Do cấu trúc hóa học, chúng chứa các nhóm chức có khả năng ion hóa. Ở một độ pH nhất định, các phân tử này tồn tại trong dung dịch dưới dạng ion tích điện dương hoặc âm.
Nguyên lý cơ bản của quá trình điện di: Các phân tử tích điện di chuyển trong điện trường.
Khi đặt trong điện trường, các phân tử sinh học đã ion hóa sẽ di chuyển. Tốc độ di chuyển của chúng khác nhau tùy thuộc vào khối lượng và điện tích. Các hạt mang điện tích âm (anion) di chuyển về phía điện cực dương, trong khi các hạt mang điện tích dương (cation) bị hút về phía điện cực âm. Sự khác biệt về tốc độ di chuyển này cho phép tách các phân tử khác nhau.
CÁC HÌNH THỨC ĐIỆN DI PHỔ BIẾN
Có nhiều hình thức điện di khác nhau, mỗi loại phù hợp với các ứng dụng cụ thể. Sự khác biệt chính giữa chúng nằm ở loại dung dịch đệm và ảnh hưởng của nó đến khả năng di chuyển của các hạt mang điện. Dưới đây là một số hình thức điện di phổ biến:
-
Điện di ranh giới di chuyển (Moving boundary electrophoresis)
Điện di ranh giới di chuyển là hình thức điện di cổ điển. Mẫu được phân tách trong dung dịch tự do, thường là trong ống hoặc ống mao quản, và độ pH được giữ không đổi trong suốt quá trình.
Ưu điểm của phương pháp này là khả năng đo chính xác sự di chuyển của các hạt mà không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố ngoại lai. Tuy nhiên, nó cũng dễ bị ảnh hưởng bởi dòng đối lưu và có độ phân giải thấp do sự trộn lẫn của mẫu trong dung dịch đệm, dẫn đến sự chồng chéo của các thành phần có đặc điểm tương tự.
-
Điện di vùng (Zone electrophoresis – ZE)
Điện di vùng (ZE) tương tự như điện di ranh giới di chuyển, nhưng sử dụng thêm một môi trường hỗ trợ hoặc chất nền để giảm dòng đối lưu và ngăn chặn sự khuếch tán mẫu không kiểm soát. Chất nền này thường có tác dụng sàng lọc, ảnh hưởng đến sự phân tách điện di.
Trong ZE, mẫu được bao quanh bởi dung dịch đệm điện di và được phân tách trong chất nền trong một khoảng thời gian nhất định. Khi có dòng điện, các mẫu di chuyển với tốc độ khác nhau, phụ thuộc vào khối lượng và điện tích của chúng. Sau khi kết thúc quá trình phân tách, các thành phần có đặc điểm tương tự sẽ tập hợp lại thành các vùng riêng biệt.
Điện di trên gel là một ví dụ phổ biến của ZE, sử dụng gel polymer làm chất nền sàng. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu hóa sinh và sinh học phân tử nhờ tính đơn giản và linh hoạt. Tuy nhiên, do có sự hiện diện của môi trường hỗ trợ, ZE không thích hợp để phân tích khả năng di chuyển của các hạt hoặc xác định điểm đẳng điện (pI) của peptide hoặc protein.
-
Điện di isotacho (Isotachophoresis – ITP)
Isotachophoresis (ITP) là một hình thức điện di, trong đó tất cả các ion di chuyển với cùng vận tốc. Trong ITP, mẫu được đặt giữa hai dung dịch đệm không đồng nhất: chất điện ly đầu ở một điện cực và chất điện ly cuối ở điện cực còn lại. Cả hai chất điện ly đều có cùng loại điện tích với phân tử quan tâm trong mẫu. Khi có dòng điện chạy qua, chất điện ly đầu có độ linh động cao nhất, tiếp theo là các hạt mang điện trong mẫu và cuối cùng là chất điện ly cuối.
Điện di mao quản (CE) với các thành phần được tách biệt và phát hiện.
Khi ITP diễn ra, các hạt mang điện trong mẫu sẽ được sắp xếp theo thứ tự giảm dần độ linh động điện và nồng độ, tạo thành một vùng liên tục chứa các hạt có đặc điểm tương tự, được kẹp giữa các ion đầu và cuối. Thông tin từ ITP được thể hiện dưới dạng đồ thị cường độ điện trường theo thời gian, cho biết danh tính của hạt mang điện và nồng độ của nó.
Một hạn chế của ITP là chỉ có thể xác định một loại điện tích trong một lần chạy. Cần một vòng ITP khác để thu thập thông tin về các hạt mang điện tích khác.
-
Điện di đẳng điện (Isoelectric focusing – IEF)
Điện di đẳng điện (IEF) được thực hiện trong một gradient pH, chạy từ thấp đến cao (từ cực dương đến cực âm). IEF chỉ áp dụng cho các phân tử lưỡng tính, có khả năng cho và nhận proton, hoạt động như axit và bazơ. Peptide và protein là những ví dụ điển hình của các phân tử lưỡng tính.
Khi gradient pH được thiết lập và dòng điện được áp dụng, một mẫu lưỡng tính sẽ di chuyển về phía cực dương hoặc cực âm, tùy thuộc vào điện tích thực của nó. Tại điểm đẳng điện (pI), điện tích thực của mẫu bằng không, vận tốc và độ linh động điện của phân tử lưỡng tính trở thành 0, làm dừng sự di chuyển.
Cả bốn hình thức điện di trên đều có thể được thực hiện ở hai chiều (2D). Điện di hai chiều (2D) bao gồm việc thực hiện điện di lần đầu tiên, sau đó là điện di lần thứ hai theo hướng vuông góc với hướng thứ nhất. Điện di 2D cung cấp thêm thông tin và độ phân giải, đặc biệt hữu ích cho các mẫu lâm sàng hoặc mẫu thực địa, thường đòi hỏi phân tích chuyên sâu và mô tả đặc điểm nhưng chỉ có sẵn với số lượng hạn chế.
CÁC LOẠI ĐIỆN DI PHỔ BIẾN DỰA TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐIỆN DI
-
Điện di trên gel (Gel Electrophoresis)
Điện di trên gel sử dụng gel, một mạng lưới polymer liên kết ngang, làm môi trường hỗ trợ để duy trì độ pH ổn định trong dung dịch đệm và ngăn chặn dòng đối lưu. Gel cũng đóng vai trò như một chất nền phân tách, với cấu trúc xốp giúp lọc các hạt lớn và cản trở các hạt nhỏ hơn trong quá trình điện di.
Điện di trên gel: Các dải phân tử được tách ra dựa trên kích thước.
Gel thường được đúc thành dải hoặc tấm có các giếng để chứa mẫu. Sau khi gel đã polyme hóa hoàn toàn, nó được ngâm trong dung dịch đệm điện di, và các mẫu được nạp vào các giếng trước khi dòng điện được áp dụng để bắt đầu quá trình phân tách. Khi kết thúc quá trình điện di trên gel, các thành phần trong mẫu sẽ được tách ra dựa trên kích thước của chúng.
Điện di trên gel là một trong những loại điện di được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu và chẩn đoán do tính dễ sử dụng và tính linh hoạt của nó. Nó có thể được điều chỉnh để tách nhiều loại phân tử sinh học khác nhau bằng cách thay đổi loại polymer được sử dụng để đúc gel và bằng cách điều chỉnh thành phần của polymer, từ đó thay đổi kích thước lỗ của gel.
Các loại gel phổ biến:
- Polyacrylamide: Gel polyacrylamide là một loại gel trong suốt được tạo ra từ sự đồng trùng hợp của các monomer acrylamide với sự có mặt của chất liên kết chéo, N, N-methylene-bisacrylamide (bis-acrylamide). Phản ứng trùng hợp được xúc tác bởi amoni persulphat (APS) và N, N, N ‘, N’-tetramethylenediamine (TEMED). Kích thước lỗ của gel polyacrylamide được xác định bởi nồng độ acrylamide, phải tương ứng với chất tạo liên kết chéo của nó. Nói chung, gel acrylamide nồng độ thấp (3% -15%) được sử dụng để tách DNA và protein. Gel acrylamide nồng độ cao hơn (10% -20%) thường được sử dụng trong điện di trên gel natri dodecyl sulfat (SDS) -polyacrylamide (SDS-PAGE), trong đó các protein được tách ra trong điều kiện biến tính, tùy theo kích thước của chúng.
- Agarose: Agarose là một polysaccharide mạch thẳng tự nhiên, được tạo thành từ các chuỗi galactose và 3,6-anhydrogalactose, được chiết xuất từ thạch phân lập từ rong biển đỏ. Agarose, tương tự như thạch, được bảo quản dưới dạng bột khô. Để tạo gel agarose, bột agarose được hòa tan trong dung dịch đệm thích hợp, đun nóng và để nguội đến nhiệt độ phòng. Tương tự như gel polyacrylamide, nồng độ agarose trong dung dịch đệm xác định kích thước lỗ của gel. Gel agarose thường được sử dụng ở nồng độ 0,8% (w/v) đến 5% (w/v) để tách các phân tử DNA và RNA. Agarose có thể được sử dụng kết hợp với SDS để tách các protein có trọng lượng phân tử cao, điều này có thể khó khăn khi sử dụng SDS-PAGE.
Gel agarose (polymer polygalactose) được sử dụng khá phổ biến, đặc biệt là trong ứng dụng với những đa phân tử như acid nucleic, lipoprotein…
-
Điện di gel trường xung (Pulsed-field Gel Electrophoresis – PFGE)
Điện di gel trường xung (PFGE) là một biến thể của điện di trên gel, trong đó hai điện trường được áp dụng định kỳ, xoay vòng, vào gel ở các góc độ khác nhau. Loại điện di này được thiết kế đặc biệt để tách nhiễm sắc thể, là các phân tử DNA có trọng lượng phân tử cao trên 20 kilobase.
Không giống như các phân tử DNA nhỏ hơn, các phân tử DNA trọng lượng phân tử cao ở dạng cuộn lại, khiến chúng di chuyển theo một cách thức không phụ thuộc vào kích thước. Trong quá trình áp dụng điện trường đầu tiên, các phân tử DNA cuộn lại sẽ được kéo căng và di chuyển qua gel. Tuy nhiên, sự kết thúc và sự thay đổi hướng của điện trường buộc các phân tử DNA lớn này phải tự định hướng lại trước khi quá trình di chuyển có thể tiếp tục.
Các phân tử lớn hơn sẽ chậm hơn trong quá trình tái định hướng và di chuyển so với các phân tử nhỏ hơn do thời gian giãn nhớt lâu hơn. Việc áp dụng lặp đi lặp lại hai điện trường xen kẽ từ các góc khác nhau cuối cùng sẽ dẫn đến khoảng cách di chuyển xa hơn đối với phân tử DNA có trọng lượng phân tử nhỏ hơn và khoảng cách di chuyển ngắn hơn đối với DNA có trọng lượng phân tử lớn hơn.
-
Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis – CE)
Điện di mao quản (CE), còn được gọi là Điện di mao quản hiệu suất cao (HPCE), là một loại điện di được thực hiện trong một ống mao quản hẹp được ngâm trong dung dịch đệm điện phân. Đây là loại điện di duy nhất có khả năng thực hiện cả bốn loại điện di đã nêu trên. Mao quản thường dài 20-30 cm và có đường kính trong 25-75 micromet.
Sự phân tách điện di được bắt đầu khi một mẫu được đưa vào mao quản bằng điện áp cao hoặc áp suất, và điện trường cao được áp dụng qua mao quản. Các thành phần trong mẫu được phân tách dọc theo chiều dài của mao quản, dựa trên định dạng điện di được sử dụng. Ở đầu kia của ống mao dẫn, các thành phần đã tách biệt được phát hiện tại một máy dò, nơi thời gian phát hiện (thời gian lưu) được tự động ghi lại.
Vì CE được thực hiện trong một ống mao quản hẹp nên chỉ cần một thể tích mẫu rất nhỏ để tách. Một ưu điểm chính khác của CE là hệ thống thiết bị đo đạc tự động, cho phép phân tích thông lượng cao.
-
Điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis)
Điện di miễn dịch là một loại điện di tách các kháng nguyên riêng biệt, bao gồm protein và peptide, dựa trên phản ứng và tính đặc hiệu của chúng đối với kháng thể (globulin miễn dịch – Ig). Sự gắn kết của kháng nguyên với kháng thể tương ứng của nó ở một tỷ lệ kháng nguyên/kháng thể cụ thể (điểm tương đương) sẽ dẫn đến sự kết tủa của phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Do đó, các kháng nguyên trong một mẫu có thể được tách ra dựa trên khả năng liên kết của chúng với một kháng thể nhất định.
Các thiết lập hiện đại cho điện di miễn dịch dựa trên các sửa đổi của điện di vùng và điện di trên gel. Điện di miễn dịch có thể được thực hiện ở chế độ một chiều hoặc hai chiều.
-
Điện di ái lực (Affinity Electrophoresis)
Điện di ái lực là một loại điện di phân tách một phân tử sinh học tương tác hoặc liên kết với một phân tử khác mà nó có ái lực. Nó sử dụng hiện tượng độ linh động điện thay đổi khi một phân tử sinh học (axit nucleic, protein, peptide và polysaccharide) liên kết với một phân tử khác. Sự thay đổi này sẽ được phản ánh trong dạng điện di.
Do đó, các phân tử sinh học quan tâm trong một mẫu có thể được tách ra dựa trên ái lực của chúng với một phân tử khác. Các thiết lập hiện đại cho điện di ái lực dựa trên điện di gel hoặc điện di mao quản (Kinoshita và cộng sự, 2015).
THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG ĐIỆN DI
Tất cả các loại điện di đều tách các hạt mang điện trong dung dịch đệm. Do đó, chúng đều cần một nguồn điện và một bộ phận điện di, thường được gọi là buồng điện di. Nguồn điện cung cấp dòng điện cho buồng để thúc đẩy quá trình phân tách điện động. Buồng này bao gồm hai điện cực đối diện (cực âm và cực dương) và một bể chứa dung dịch đệm, nơi các mẫu và quá trình phân tách diễn ra (Walker, 2010).
Bộ điện di đứng: Thiết bị cơ bản để thực hiện điện di.
Việc sử dụng nguồn điện và buồng điện di là bắt buộc đối với tất cả các loại điện di. Tuy nhiên, mỗi loại điện di đòi hỏi thiết bị cụ thể để thiết lập quá trình tách. Ví dụ, khay đúc gel, tấm kính và lược là điều kiện tiên quyết cho điện di gel. Điện di mao quản yêu cầu một hệ thống làm mát bên trong có hiệu quả ngăn chặn sự gia nhiệt quá mức và cung cấp một điều kiện ổn định nhiệt trong quá trình điện di.
KẾT LUẬN
Điện di là một kỹ thuật tách mạnh mẽ, có khả năng phân tách các phân tử sinh học hoặc các hạt mang điện dựa trên độ linh động của chúng trong điện trường. Độ linh động này có thể phản ánh các đặc điểm vốn có của phân tử hoặc là kết quả của sự tương tác với một phân tử khác. Khi kết hợp với các kỹ thuật khác, điện di trở thành một công cụ toàn diện, có thể ứng dụng trong nghiên cứu, phân tích và chẩn đoán.